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明治二年（1869年）4月9日。
新政府軍到達北海道，開始登陸作戰。新政府軍人多勢眾，加之武器精良，在一個月之內已經攻克江差、木古內等重要據點。
土方歲三和本武揚的軍隊被逼到函館，敗局已定。同本武揚一起離開江戶，一直充當軍事顧問的法國顧問布利奈也無力回天。他最終辭彆了土方歲三和本武揚，登上法國軍艦離開了北海道。
五月七日，函館灣海戰中，本軍最後一艘完好無損的軍艦回天也被新政府軍的艦隊擊毀。幕府軍隻能堅守函館，進行陸地攻防戰。
5月11日，新政府軍發動了函館總攻擊。新政府軍分三路同時衝擊本軍的陣營，同時，停泊在七重浜的新政府軍軍艦“朝陽”、“丁卯”還不斷向本軍陣地發射火炮，以掩護新政府軍前進。但是，新政府軍萬萬沒有想到，本軍還有一艘名為“蟠龍”的軍艦，它在函館灣海戰中因正在維護而未能出戰，因此攻擊力並未被破壞。在政府軍的“朝陽”、“丁卯”向陸地密集發射火炮之時，“蟠龍”突然出現，並一炮擊中猝不及防的“朝陽”艦。“朝陽”艦因炮擊而爆炸，轉眼陷入一片火海。正在衝鋒的新政府軍軍士看見“朝陽”艦不但起火，還冒著濃煙不斷下沉，不禁被嚇得目瞪口呆。
此時，土方歲三率著援軍剛剛趕到七重浜，看到新政府軍士氣受挫，頓時覺得是一個千載難逢的機會。他立刻離開七重浜，前去支援地勢最為險要的函館一本木關門。
土方歲三命在一本木關門鎮守的原幕府陸軍奉行添役大野右仲將殘兵集合，從另一方向出擊。自己則率領50名敢死隊隊員死守一本木關門，與新政府軍激戰。
土方歲三端坐馬上，在槍林彈雨之中指揮自如，新政府軍看到敢死隊員悍不懼死，陣腳大亂。
但縱然千般英武，畢竟還是肉身，穿行在槍林彈雨中的土方歲三終於被流彈擊中腹部，傷重落馬。
身邊的新選組隊員島田魁、相馬主計等前去援助，將身受重傷的土方歲三扶起。滿身是血的土方歲三慢慢抬起眼睛，輕聲說了句：
“對不起”，便停止了呼吸。享年35歲。