4.準備70c溫浴。
5.使用前檢查bufferbL是否有沉澱析出,若出現沉澱,請於70c溫浴加熱至沉澱完全溶解後再使用。
完成試劑準備工作之後,在鐘教授的首肯之下,研究員開始進行dNA的提取。
具體操作步驟如下:
1.向96圓孔板的每孔中加入20ul蛋白酶K。
2.加200ul抗凝全血到96圓孔板中。
~undefed若全血樣品體積少於200ul,用pbS補充到200ul。
~undefed若樣品為鳥類血,樣品用量須低於10ul。
~undefed若需得到RNA-free的基因組dNA,在步驟3加入bufferbL前加入dNase-free的RNaseA(20g\/l)。
3.加200ulbufferbL,注意不要打濕每孔的邊緣,用96圓孔矽膠片密封各孔。
4.用力混合30s。
5.3000rp簡短離心使96圓孔矽膠片上的溶液到96圓孔板內。啟動離心機,當速度達到3000rp後即停止。
6.在培養箱或烘箱中70c溫浴至少10。
7.3000rp簡短離心使96圓孔矽膠片上的溶液到96圓孔板內。啟動離心機,當速度達到3000rp後即停止。
8.取下96圓孔矽膠片,每孔加入200ul乙醇(96-100%)。
9.用96圓孔矽膠片密封各孔,用力混勻混合15s。3000rp簡短離心使96圓孔矽膠片上的溶液到圓孔板內。啟動離心機,當速度達到3000rp後即停止。
10.將96孔dNA板放到一潔淨的96孔1.6l深孔板。取下圓孔板上的96圓孔矽膠片,將每孔中的溶液轉移至96孔dNA板中,6000rp離心4。
11.丟棄96孔1.6l深孔板的濾液,將96孔dNA板放回到96孔1.6l深孔板上,每孔加入500ulbufferw1b,用一新的bF-400膜密封96孔dNA板,6000rp離心4。
~undefed確認在bufferw1btrate中已按試劑瓶上的指定體積加入無水乙醇。
12.丟棄96孔1.6l深孔板的濾液,將96孔dNA板放回到96孔1.6l深孔板上,每孔加入850ulbufferw2,用另一新的bF-400膜密封96孔dNA板,6000rp離心4。
~undefed確認在bufferw2trate中已按試劑瓶上的指定體積加入無水乙醇。
13.棄濾液,將96孔dNA板放回到96孔1.6l深孔板上,每孔加入400ulbufferw2,用另一新的bF-400膜密封96孔dNA板,6000rp離心4。
14.將96孔dNA板放在一潔淨的96孔1.6l深孔板上,用bF-400膜密封96孔dNA板,6000rp離心15。
15.將96孔dNA板放在另一潔淨的96孔1.6l深孔板上,每孔加入100-200ulEentb或去離子水,室溫靜置2,用另一新的bF-400膜密封96孔dNA板,6000rp離心4洗脫得到dNA。
看著最終提取出來的dNA樣本,鐘教授終於露出了滿意的微笑......